Una volta risolta la questione delle rane nate dalla pioggia, Redi e gli Accademici del Cimento erano passati, intorno alla metà degli anni '60, ad affrontare il nucleo centrale della controversia sulla generazione spontanea: la generazione delle larve e degli insetti delle carni putrefatte.
Le conclusioni, frutto di un lavoro sperimentale durato anni, vennero presentate da Redi nelle Esperienze intorno alla generazione degl'insetti . Pubblicato all'inizio del settembre 1668, dopo una lunga e sofferta gestazione editoriale, il capolavoro rediano avrebbe suscitato in pochi anni le reazioni contrastanti di molti scienziati europei, prima di diventare una pietra miliare nella storia della biologia moderna.
I termini del problema della generazione spontanea della vita erano apparsi evidenti già nell'antichità: da dove provenivano vermi ed insetti che comparivano all'improvviso in tutte le più diverse sostanze putrefatte e in decomposizione, e dei quali non si vedeva traccia di possibili progenitori? La prima risposta, e anche la più ovvia, era stata che essi venivano prodotti direttamente dalla materia per generazione spontanea. Redi fece a pezzi questo dispositivo logico-empirico, che era apparso fino ad allora assolutamente scontato ed intuitivo, al pari della centralità e dell'immobilità della Terra.
Lo scienziato aretino ebbe il coraggio, davvero rivoluzionario, di mettere in discussione non tanto le teorie esplicative ma il fenomeno stesso della generazione spontanea, e di affermare, almeno in linea generale, il principio dell'universalità della generazione parentale, cioè, come si diceva allora, della generazione ex semine o ex ovo. Anche se poi finì per ammettere una vistosa eccezione a questa legge di natura nel caso dei parassiti degli animali e degli insetti delle galle delle piante, per i quali ammise una qualche forma di xenogenesi.
Ma soprattutto Redi pervenne a questa conclusione basandosi su un'innovazione metodologica destinata a fare epoca nella storia della cultura occidentale, perché per la prima volta il compito di dirimere le controversie teoriche venne sottratto alle dispute filosofiche e alle costrizioni del principio di autorità, e demandato esclusivamente al procedimento delle esperienze "iterate e reiterate". Non alla semplice osservazione e all'esperienza (anche gli aristotelici, infatti, osservavano e facevano esperienze), ma ad esperimenti impostati, pensati e realizzati in modi completamente nuovi. Era la prima, vera, sistematica applicazione del metodo sperimentale alla biologia.
Per realizzare questa impresa, Redi ricorse semplicemente a carta, spago e garze. Con questi accorgimenti chiuse i recipienti in cui faceva gli esperimenti, proteggendo le sostanze in via di decomposizione dall'inquinamento portato da insetti che vi deponevano le loro uova. L'errore di Aristotele e di tutti gli altri che gli avevano creduto erano stato, dunque, un errore di visibilità: non avevano visto volare gli insetti sopra le sostanze in via di putrefazione, o meglio non avevano collegato la loro presenza con la successiva generazione delle larve, dal momento che non conoscevano il principio della universalità della generazione tramite uova.
Redi aveva messo a punto un dispositivo di isolamento, che escludeva qualsiasi rischio di contaminazione esterna dei reperti esaminati. Aveva sigillato perfettamente i recipienti. In questo modo aveva aperto una tradizione sperimentale che sarebbe stata ripresa, relativamente ai microrganismi delle infusioni, da John Turberville Needham e Lazzaro Spallanzani nel Settecento, e conclusa da Louis Pasteur nell'Ottocento.
La confutazione della generazione spontanea venne realizzata da Redi grazie ad un esperimento di portata epocale che introduceva nella storia del metodo scientifico la procedura seriale e il confronto tra esperimenti di ricerca ed esperimenti di controllo. Si trattava di una prassi assolutamente inedita che, utilizzando nei diversi esperimenti gli stessi componenti e variando un unico parametro (il contatto con l'aria esterna), consentiva di valutare in modo assolutamente conclusivo la sua incidenza nella genesi del fenomeno. Redi preparò una serie di otto recipienti riempiti di vari tipi di carne, di cui quattro li lasciò all'aria aperta e gli altri quattro li sigillò accuratamente. Il risultato si dimostrò subito inequivocabile: solo i primi campioni, nei quali le mosche avevano potuto posarsi sulla carne e deporvi le uova, avevano dato origine a larve che poi si erano sviluppate in mosche identiche alle prime. La carne dei recipienti sigillati, invece, era diventata anch'essa putrida e si era decomposta,
ma senza dar luogo a nessuna forma di vita.
La ricerca era stata condotta esclusivamente a livello macroscopico ed il microscopio era stato impiegato da Redi solo per confermare l'interpretazione dell'esperimento in chiave di generazione parentale, evidenziando la presenza di un apparato ovo-produttore nel corpo dell'insetto femmina e la specificità delle uova deposte dalle diverse specie di insetti. Ma ecco il resoconto del primo esperimento rediano, semplice e perfetto nella sua logica consequenzialità:
"A mezzo il mese di luglio in quattro fiaschi di bocca larga misi una serpe, alcuni pesci di fiume, quattro anguillette d'Arno ed un taglio di vitella di latte; e poscia, serrate benissimo le bocche con carta e spago e benissimo sigillate, in altrettanti fiaschi posi altrettante delle suddette cose, e lasciai le bocche aperte: né molto passò di tempo, che i pesci e le carni di questi secondo vasi diventarono verminose, ed in essi vasi vedevansi entrare ed uscir le mosche a lor voglia. Ma ne' fiaschi serrati non ho mai veduto nascere un baco".
L'esperimento dei recipienti aperti e sigillati, pur nella sua straordinaria perfezione, non poteva essere considerato conclusivo. Se infatti esso stabiliva con certezza che la causa della produzione delle larve proveniva dall'esterno, attraverso l'aria, non chiariva, al di là di ogni possibilità di dubbio, se la causa effettiva della nascita delle larve erano davvero le mosche o qualcos'altro che, insieme alle mosche, penetrava con l'aria dentro i recipienti aperti. Qualcuno poteva obiettare, come fe-cero i difensori della generazione spontanea per bocca del gesuita Filippo Buonanni, che la chiusura ermetica dei recipienti, impedendo l'afflusso d'aria, potesse aver alterato le normali condizioni che garantivano il ciclo vitale delle larve e compromesso così l'esito della ricerca.
Allo scopo di ristabilire le stesse condizioni ambientali sia nell'esperimento di ricerca che nell'esperimento di controllo, ed escludere la possibilità che l'assenza di contatto con l'aria potesse costituire il fattore determinante della mancata comparsa delle larve, Redi immaginò una variante di assoluta genialità. Rifece l'esperimento utilizzando due altre serie identiche di recipienti, ma nei campioni di controllo fece in modo, con un accorgimento tecnico semplicissimo, che l'accesso ai recipienti fosse consentito solo ad aria pura, che non poteva contenere nessun elemento contaminante proveniente da insetti volanti: chiuse i recipienti con un filtro di sottilissimo velo. In questo modo l'aria poteva arrivare a contatto della carne, ma non le mosche che continuavano ad aggirarsi affannosamente sul coperchio. E questo era davvero l'esperimento cruciale che, stabilendo in modo assolutamente certo che "non invermina animale alcuno che morto sia", segnava una pietra miliare nella storia della biologia. Ecco
come Redi descriveva il secondo esperimento:
"Per tor via ogni dubbio ed ogni opposizione che potesse esser fatta per cagione delle prove tentate ne' vasi serrati, ne' quali l'ambiente aria non può entrare e uscire né liberamente in quegli rinnovarsi, volli ancor tentar nuove esperienze col metter le carni ed i pesci in un vaso molto grande e, acciocché l'aria potesse penetrarvi, serrato con sottilissimo velo di Napoli, e rinchiuso in una cassetta a guisa di moscaiuola, fasciata pure con lo stesso velo".
Si trattava di un vero e proprio experimentum crucis. L'aria rientrava nei recipienti, ma non gli insetti. La causa della nascita delle larve non stava in una misteriosa forza della materia, ma nelle uova deposte da genitori della stessa specie. A nulla sarebbero valse le notizie, del tutto infondate, diffuse dai gesuiti su una presunta ritrattazione di Redi, che tentavano di fare leva sulle indecisioni dello scienziato aretino relativamente agli insetti delle galle per inficiare il principio della generazione parentale. La millenaria credenza nella generazione spontanea degli insetti era stata sconfitta per sempre, almeno a livello di organismi superiori. Omne vivum ex ovo aveva scritto nel 1651 William Harvey. Dopo di lui, anche per merito di Redi, questa affermazione sarebbe stata assunta da generazioni di filosofi e scienziati come una delle parole d'ordine della modernità.