Nato ad Arezzo nel 1524 o 1525, studiò medicina a Pisa, con Realdo Colombo e Luca Ghini, laureandosi nel 1551. Rimasto a Pisa a studiare la filosofia aristotelica, nel 1555 ottenne di succedere a Ghini nella carica di Prefetto del Giardino dei semplici e lettore di materia medica, mentre dal 1569 al 1592 ricoprì la cattedra di medicina. Dal 1582 venne prescelto anche per la prestigiosa condotta di medico dell'Ordine dei Cavalieri di Santo Stefano. Mantenne costantemente una fitta corrispondenza epistolare con numerosi scienziati europei e riunì presso di sé una larga e ben preparata cerchia di allievi, tra i quali la tradizione annovera, dal 1582 al 1584, anche Galileo.
Tra i corrispondenti di Cesalpino si trovava Alfonso Tornabuoni al quale, nel 1563, egli inviò una lettera, divenuta poi celebre, che raccoglieva alcuni principi di classificazione botanica del tutto innovativi applicati a un erbario secco di settecentosessantotto piante, corredato dalla relativa nomenclatura. L'erbario era stato messo a punto grazie ad una serie di viaggi naturalistici per la Toscana, le Marche e la Liguria che egli aveva affrontato insieme ad alcuni allievi durante i primi dieci anni dell'attività pisana. All'inizio degli anni settanta venne incaricato dal Papa Pio V di raccogliere semplici per la fondazione di un orto botanico a Roma. Mentre la sua fama di medico e di aristotelico aperto e liberale si affermava, scoppiò in Pisa un'aspra contesa tra i professori. Cesalpino venne preso di mira dalle polemiche diffamazioni del lettore platonico Francesco Verino Secondo, che lo mise in cattiva luce presso il Granduca Ferdinando I, con l'accusa di eresia e di telesianismo.
Amareggiato da queste polemiche, Cesalpino si trasferì a Roma nel momento in cui a Pisa sopraggiungeva Girolamo Mercuriali chiamato a sostituirlo. A Roma, divenne Archiatra di Clemente VIII nel 1592 e docente di medicina alla Sapienza. Morì a Roma il 15 marzo 1603.
Durante il periodo pisano Cesalpino aveva stampato le sue maggiori opere. I Quaestionum peripateticarum libri quinque del 1569, in cui aveva espresso una serie di originali concezioni naturalistiche, tra le quali spiccava certamente l'affermazione della centralità del cuore nell'economia del corpo umano e la sua funzione propulsiva nel trasferire il sangue in circolo. La scoperta veniva successivamente esplicitata nei Quaestionum medicarum Libri duo del 1593. Questa geniale intuizione venne elaborata più tardi da William Harvey nel De motu cordis et sanguinis del 1628, in cui tuttavia il nome di Cesalpino non veniva mai citato, anche se molto probabilmente il medico inglese era venuto a conoscenza delle sue idee nel corso degli studi universitari fatti a Padova.
Nel 1571 Cesalpino pubblicò le Quaestiones medicae, nelle quali l'importanza della circolazione del sangue per le funzioni fisiologiche del corpo e per la diffusione del calore veniva decisamente ribadita, anche su basi sperimentali. Nel 1583 compariva il De plantis: un manuale dove si trovavano descritte più di millecinquecento piante, presentate secondo la sua nuova classificazione fitologica basata sulla struttura degli organi della riproduzione. Nel corso del soggiorno romano Cesalpino stampò anche i tre libri De metallicis (1596), come continuazione della Methalloteca Vaticana di Mercati, in cui avanzò alcune ipotesi inerenti alla origine dei fossili e alle leggi della cristallizzazione. Tornò sulla circolazione del sangue nella sua ultima opera, la Praxis universae artis medicae, stampata tra il 1602 e il 1603.
Come aretino ed appassionato bibliofilo, Redi aveva letto e conosceva bene le opere di Cesalpino. In un protocollo del 4 aprile 1667, stilato a Livorno e conservato nel Ms. 34 della Biblioteca Marucelliana di Firenze, egli annotava di aver parlato con un "ebreo" di una pianta denominata "grana paradisi". E concludeva: "Vedi il Cesalpino". Inoltre, nelle Osservazioni intorno agli animali viventi che si trovano negli animali viventi , Redi si riferiva con giusto orgoglio cittadino al "dottissimo Andrea Cesalpino di Arezzo", il quale era stato "uno de' primi scopritori della circolazione del sangue".